我們在準備反相液相色譜儀的流動(dòng)相時(shí)，甲醇和乙腈被廣泛用作有機溶劑。但是為什么有時(shí)候使用甲醇，而有時(shí)候使用乙腈呢？這兩種有機溶劑之間有什么區別呢？
乙腈＆甲醇的性質(zhì)
乙腈是一種極性的不可電離非質(zhì)子酸，由于存在由于存在C≡N，它可以帶來(lái)π-π相互作用，又因為氮原子具有高電負性，它也可以與另一分子形成氫鍵。甲醇是一種極性的可電離質(zhì)子酸，它可以和另一個(gè)分子相互作用形成氫鍵。為什么甲醇也可以形成氫鍵呢？因為甲醇上有-OH的存在，氧是高電負性原子，它可以部分極化分子。它在氧上產(chǎn)生微負電荷，在氫原子上產(chǎn)生微正電荷。因此，這個(gè)微正電荷的氫原子可以與微負電荷的原子形成氫鍵。
那么什么是極性可電離質(zhì)子溶劑？極性可電離質(zhì)子溶劑指的是具有氫原子與氧（如羥基）、氮（如胺基）或氟（如氟化氫）結合的溶劑。乙腈中存在氫原子，但這些氫原子不與氧形成氫鍵，因此，不能說(shuō)乙腈是可電離的極性溶劑。而甲醇，氫原子可以與氧形成氫鍵，因此，甲醇是可電離極性溶劑。
截止波長(cháng)
當使用這些有機溶劑配制流動(dòng)相，選擇檢測波長(cháng)時(shí)，了解它們的紫外截止波長(cháng)是非常重要的。乙腈與甲醇相比，它的截止波長(cháng)更低，約為190nm，而甲醇約為210nm，這意味著(zhù)使用乙腈時(shí)可以在190nm的低波長(cháng)下進(jìn)行檢測，但使用甲醇作為有機溶劑，可能無(wú)法使用低于210nm的波長(cháng)，因為此時(shí)會(huì )產(chǎn)生很多基線(xiàn)噪音。
經(jīng)濟成本
另一個(gè)重要因素是甲醇和乙腈的經(jīng)濟成本。乙腈價(jià)格高于甲醇，因此當有可能使用甲醇代替乙腈時(shí)，可以使用甲醇以節省實(shí)驗室成本。
有機溶劑比與柱壓的關(guān)系
我們的HPLC系統一般能承受的背壓約為4000psi，超過(guò)這個(gè)數值泵就無(wú)法工作。因此，應優(yōu)先選擇產(chǎn)生最小背壓的流動(dòng)相。有機溶劑和背壓之間存在怎樣的關(guān)系呢？在上圖中，使用色譜柱：ODS（150mm×4.6mm，5μm），流  速：1.0ml/min，比較了乙腈與水和甲醇與水混合物在不同條件的壓力。由于較高的溫度導致溶劑的粘度降低，壓力也趨向降低。將柱溫設置在25~40℃之間進(jìn)行比較，我們可以看到甲醇的壓力更高。因此，將流動(dòng)相中的乙腈替換為甲醇時(shí)，需要重新評估儀器系統和色譜柱的耐壓能力。
乙腈＆甲醇的溶劑強度比較
現在我們來(lái)了解一下這兩種重要有機溶劑的強度。當乙腈和甲醇以相同的比例與水混合時(shí)，乙腈流動(dòng)相的洗脫強度更大。
分析以下6種分析物：甲基對羥基苯甲酸酯，乙基對羥基苯甲酸酯，異丙基對羥基苯甲酸酯、丙基對羥基苯甲酸酯、異丁基對羥基苯甲酸酯以及正丁基對羥基苯甲酸酯。這些對羥基苯甲酸酯在甲醇中的流動(dòng)相中，它們都可以被有效地保留，但是當換成到乙腈時(shí)，保留時(shí)間會(huì )大大降低。這個(gè)實(shí)驗證明了乙腈在反相液相色譜中的洗脫能力更強。
那么為什么甲基對羥基苯甲酸酯會(huì )先洗脫出來(lái)，而正丁基對羥基苯甲酸酯卻最后才洗脫出來(lái)？看一下甲基對羥基苯甲酸酯和丁基對羥基苯甲酸酯的結構，甲基對羥基苯甲酸酯的碳鏈長(cháng)度較短，而正丁基對羥基苯甲酸酯的碳鏈長(cháng)度較長(cháng)。碳鏈長(cháng)度的變化會(huì )影響化合物的非極性，碳鏈較短的化合物非極性較弱，因此在這種情況下，可以清楚地看到正丁基對羥基苯甲酸酯與甲基對羥基苯甲酸酯相比非極性更強。
甲醇和乙腈的選擇性差異
下一個(gè)重要的點(diǎn)是甲醇和乙腈之間的洗脫選擇性不同，我將根據苯酚、苯甲酸和對甲苯酸的洗脫來(lái)解釋這兩種不同的選擇性。甲醇的流動(dòng)相是緩沖液：甲醇（40:60），而乙腈的流動(dòng)相是緩沖液：乙腈（60:40）。使用的色譜柱是Shim-pack VP-ODS，在這種情況下，我們會(huì )發(fā)現用甲醇時(shí)，苯酚首先洗脫，然后是苯甲酸，最后是對甲苯酸，但是在乙腈的條件下，會(huì )發(fā)現苯甲酸首先洗脫，然后是苯酚，最后是對甲苯酸。那么為什么用乙腈更容易洗脫苯甲酸呢？是什么使苯甲酸先于苯酚洗脫？
在這種情況下，我們需要了解苯甲酸與乙腈之間存在額外的相互作用，即與乙腈的碳氮三鍵和苯甲酸上的羰基氧上的π電子的π-π相互作用。因為甲醇不含π電子，因此這種π-π相互作用在甲醇中是不存在的，但在乙腈中卻很可能發(fā)生，并且由于這種額外的相互作用，苯甲酸將更喜歡存在于乙腈的流動(dòng)相中。因此，它將隨著(zhù)流動(dòng)相一起流動(dòng)，因此更快地洗脫出來(lái)。為什么對甲苯甲酸的保留時(shí)間較長(cháng)？烷基鏈的存在將疏水性帶入分子中，如果疏水性存在，則可以通過(guò)疏水相互作用與C18固定相發(fā)生相互作用?，F在，在苯酚、苯甲酸中沒(méi)有烷基鏈的存在，但是在對甲苯甲酸的情況下，有一個(gè)甲基鏈，這個(gè)甲基鏈帶來(lái)了一點(diǎn)疏水性，因此會(huì )與C18等疏水性固定相發(fā)生相互作用，這導致對甲苯甲酸與固定相之間有很好的相互作用，因此會(huì )保留更長(cháng)時(shí)間。
將乙腈＆甲醇與緩沖液混合產(chǎn)生的沉淀
在反相液相色譜中，緩沖液與有機溶劑的流動(dòng)相混合使用，此時(shí)有機溶劑的濃度過(guò)高可能會(huì )導致緩沖鹽沉淀。上表中，分別展示了常用緩沖液與乙腈或甲醇混合后是否會(huì )沉淀的情況。我們可以看到，對于某些緩沖液，無(wú)論使用哪種有機溶劑都不會(huì )發(fā)生沉淀，但通常情況下，在甲醇條件下產(chǎn)生沉淀的情況較少。