液相色譜儀檢測器的作用是將柱流出物中樣品組成和含量的變化轉化為可供檢測的信號,常用檢測器有紫外吸收、熒光、示差折光、化學(xué)發(fā)光、蒸發(fā)光散射檢測器等。
1、紫外吸收檢測器
紫外吸收(UV)檢測器是目前HPLC應用最廣泛的檢測器。其工作原理是朗伯-比爾定律。這種檢測器靈敏度高,線(xiàn)性范圍寬,對流速和溫度變化不敏感,可用于梯度洗脫分離。紫外吸收檢測要求被檢測樣品組分有紫外-可見(jiàn)光吸收,而使用的流動(dòng)相無(wú)吸收,或在被測組分吸收波長(cháng)處無(wú)吸收。一般選擇在欲分析物有最大吸收的波長(cháng)處進(jìn)行檢測,以獲得最大靈敏度和抗干擾能力。在沒(méi)有最大吸收時(shí),可采用末端吸收。檢測波長(cháng)的選擇除取決于待測物質(zhì)的成分和分子結構外,還必須考慮流動(dòng)相組成、共存組分干擾等因素。特別是各種溶劑都有一定的透過(guò)波長(cháng)下限值,超過(guò)這個(gè)波長(cháng),溶劑的吸收會(huì )變得很強,以至于不能很好地測出待測物質(zhì)的吸收強度。下表列出了HPLC中一些常用的溶劑透過(guò)波長(cháng)的下限。
2、光電二極管陣列檢測器
光電二極管陣列檢測器(photodiode array detector,PDAD)又稱(chēng)快速掃描紫外可見(jiàn)分光度計,是一種新型的光吸收檢測器。它采用光電二極管陣列作為檢測元件,形成多通道并行工作,同時(shí)它對光柵分離的所有波長(cháng)的光信號進(jìn)行檢測,然后將其入射到陣列接收機,然后快速掃描二極管陣列來(lái)采集數據,得到吸收值(A)是保留時(shí)間(tR)和波長(cháng)(L)函數的三維色譜光譜圖。由此可及時(shí)觀(guān)察與每一組分的色譜圖相應的光譜數據,從而迅速決定具有最佳選擇性和靈敏度的波長(cháng)。計算機化的數據處理,還可進(jìn)行色譜峰光譜相似性比較、峰純度檢測及利用譜圖庫對樣品進(jìn)行檢索等,為定性、定量分析提供更豐富的信息。
單光束二極管陣列檢測器,光源發(fā)出的光先通過(guò)檢測池,透射光由全息光柵色散成多色光,射到陣列元件上,使所有波長(cháng)的光在接收器上同時(shí)被檢測。陣列式接收器上的光信號用電子學(xué)的方法快速掃描提取出來(lái),每幅圖像僅需要10ms,遠遠超過(guò)色譜流出峰的速度,因此可隨峰掃描。
3、熒光檢測器
熒光檢測器(fluorescence detector, FD)是一種高靈敏度、有選擇性的檢測器,可檢測能產(chǎn)生熒光的化合物。熒光檢測器的原理與熒光分析法相同,化合物受紫外光激發(fā)后,發(fā)射出比激發(fā)光波長(cháng)更長(cháng)的光,稱(chēng)為熒光或發(fā)射光。許多藥物和生命活性物質(zhì)具有天然熒光,能直接檢測,某些不發(fā)熒光的物質(zhì)可通過(guò)化學(xué)衍生化生成熒光衍生物,然后進(jìn)行熒光檢測。其最小檢測濃度可達0.1ng/mL,適用于痕量分析。一般情況下,熒光檢測器的靈敏度比紫外檢測器約高2個(gè)數量級,但其線(xiàn)性范圍不如紫外檢測器寬。近年來(lái),采用激光作為熒光檢測器的光源而產(chǎn)生的激光誘導熒光檢測器極大地增強了熒光檢測的信噪比,因而具有很高的靈敏度,在痕量和超痕量分析中得到廣泛應用。
4、示差折光檢測器
示差折光檢測器(differential refractive Index detector, RID)是一種通用的濃度檢測器,對所有溶質(zhì)都有響應。某些不能用選擇性檢測器檢測的組分,如高分子化合物、糖類(lèi)、脂肪烷烴等,可用示差檢測器檢測。示差檢測器是基于連續測定樣品流路和參比流路之間折射率的變化來(lái)測定樣品含量的。光從一種介質(zhì)進(jìn)入另一種介質(zhì)時(shí),由于兩種物質(zhì)的折射率不同就會(huì )產(chǎn)生折射。只要樣品組分與流動(dòng)相的折光指數不同,就可被檢測,二者相差愈大,靈敏度愈高。在一定濃度范圍內檢測器的輸出與溶質(zhì)濃度成正比。
5、電化學(xué)檢測器
電化學(xué)檢測器(electrochemical detector, ECD)屬選擇性檢測器,主要有電導檢測器、安培檢測器、介電常數檢測器和電位測定檢測器等,可檢測具有電活性的化合物。電導、電位等檢測器已在離子色譜中得到了廣泛應用;介電常數檢測器性能類(lèi)似于示差折光檢測器;安培檢測器可檢測氧化性物質(zhì),適用范圍很寬。
電化學(xué)檢測器的優(yōu)點(diǎn)
靈敏度高,檢測量一般為ng級,可以達到pg級。
選擇性好,可測定大量非電活性物質(zhì)中極痕量電活性物質(zhì);
線(xiàn)性范圍寬,通常為4~5個(gè)數量級;
設備簡(jiǎn)單,成本較低;
易于自動(dòng)操作。
6、化學(xué)發(fā)光檢測器
化學(xué)發(fā)光檢測器(Chemiluminescence detector, CD)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種快速、靈敏的新型檢測器,具有設備簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉、線(xiàn)性范圍寬等優(yōu)點(diǎn)。其原理是基于某些物質(zhì)在常溫下進(jìn)行化學(xué)反應,生成處于激發(fā)態(tài)勢反應中間體或反應產(chǎn)物,當它們從激發(fā)態(tài)返回基態(tài)時(shí),就發(fā)射出光子。由于物質(zhì)激發(fā)態(tài)的能量是來(lái)自化學(xué)反應,故叫作化學(xué)發(fā)光。當分離組分從色譜柱中洗脫出來(lái)后,立即與適當的化學(xué)發(fā)光試劑混合,引起化學(xué)反應,導致發(fā)光物質(zhì)產(chǎn)生輻射,其光強度與該物質(zhì)的濃度成正比。
這種檢測器不需要光源,也不需要復雜的光學(xué)系統,只要有恒流泵,將化學(xué)發(fā)光試劑以一定的流速泵入混合器中,使之與柱流出物迅速而又均勻地混合產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光,通過(guò)光電倍增管將光信號變成電信號,就可進(jìn)行檢測。這種檢測器的最小檢出量可達10~12g。
7、蒸發(fā)光散射檢測器
蒸發(fā)光散射檢測器(evaporative light—scattering detector,ELSD)是20世紀90年代出現的新型通用型質(zhì)量檢測器,它適用于檢測揮發(fā)性低于流動(dòng)相的組分,主要用于檢測糖類(lèi)、高級脂肪酸、磷脂、維生素、氨基酸、甘油三酯及甾體等,并在沒(méi)有標準品和化合物結構參數未知的情況下檢測未知化合物。對各物質(zhì)有幾乎相同的響應,但是其靈敏度比較低,尤其是有紫外吸收的組分。此外流動(dòng)相必須是揮發(fā)性的,不能含有緩沖鹽等。它的通用檢測原理克服了常見(jiàn)于HPLC傳統檢測方法的不足,已越來(lái)越多地應用于HPLC、超臨界色譜和逆流色譜中。不同于紫外和熒光檢測器,ELSD的響應不依賴(lài)于樣品的光學(xué)特性,任何揮發(fā)性低于流動(dòng)相的樣品均能被檢測,不受其官能團的影響。靈敏度比示差折光檢測器高,對溫度變化不敏感,基線(xiàn)穩定,適合與梯度洗脫液相色譜聯(lián)用。
ELSD檢測原理
ELSD運行有三個(gè)過(guò)程:第一是霧化過(guò)程,用惰性氣體或凈化空氣將色譜柱流出物霧化;第二是蒸發(fā)過(guò)程,在一個(gè)加熱管(漂移管)中將流動(dòng)相揮發(fā);第三是檢測過(guò)程,測定留下來(lái)的樣品顆粒的光散射。所有商品ELSD都由一種或兩種模式完成這三個(gè)過(guò)程。模式A的操作是全部柱流出物(氣溶膠)都進(jìn)入直的漂移管,讓流動(dòng)相在其中蒸發(fā),模式B中是將氣溶膠通過(guò)一個(gè)彎管,在此管中大的顆粒沉積下來(lái)流入廢氣管,其余的小顆粒進(jìn)入螺旋狀的漂移管,在上述兩種模式中,樣品顆粒均進(jìn)入光管,使激光發(fā)生散射而得以檢測。
ELSD檢測的優(yōu)點(diǎn)及缺點(diǎn)
優(yōu)點(diǎn):
①具有較好的通用性,任何揮發(fā)性低于流動(dòng)相的樣品均能被檢測;
②在相同色譜條件下,物理性質(zhì)相似的物質(zhì)可給出一致的響應;
③能與梯度洗脫方式相容;
④靈敏度高于示差折光檢測器、紫外末端吸收檢測法。
⑤在ELSD上開(kāi)發(fā)的實(shí)驗方法移植到質(zhì)譜上則無(wú)需修改。
ELSD檢測的不足之處主要是:
①靈敏度不夠理想;
②流動(dòng)相的選擇受限;
③某些樣品線(xiàn)性范圍較窄等。
影響ELSD檢測性能的基本因素
①操作模式選擇,選擇合適的操作模式可提高方法的靈敏度,操作模式的選擇取決于樣品的揮發(fā)性、流動(dòng)相的組成及其流速。
②流動(dòng)相組成及流速選擇,流動(dòng)相的揮發(fā)性越好,方法的靈敏度越高。流動(dòng)相的流速越低,相應的信號越強。
③漂移管溫度對基線(xiàn)水平和噪音的影響并無(wú)明顯規律性。最優(yōu)溫度應為在流動(dòng)相基本揮發(fā)基礎上,產(chǎn)生可接受噪音的最低溫度。
④載氣流速是影響檢測性能的一個(gè)很重要因素。最優(yōu)載氣流速應是在可接受噪音的基礎上(例如0.5mV),產(chǎn)生最大檢測響應值時(shí)的最低流速。
ELSD檢測時(shí)的數據處理模式
ELSD檢測最常采用的數學(xué)模型是lgy=algx+b (y為響應值,x為進(jìn)樣量或樣品濃度,a、b為回歸常數),也有采用二次曲線(xiàn)模型的(y=ax2+bx+c)。由于響應值(y)與進(jìn)樣量(x)之間并非線(xiàn)性關(guān)系,故其數據處理不同于紫外檢測方法。ELSD測定已知物質(zhì)的含量時(shí),一般應用隨行標準曲線(xiàn)法而非外標法,因為校正線(xiàn)性方程的截距并不為零。新藥基準品的建立,除了對照品為另外一種含量已知、結構相似的物質(zhì)外,數據處理方式同上相似。ELSD測定物質(zhì)純度時(shí),由于響應值與進(jìn)樣量間并非線(xiàn)性關(guān)系,多通過(guò)繪制其中的一種或數種物質(zhì)的隨行標準曲線(xiàn)來(lái)加以校正。多組分物質(zhì)的分析,除了隨行校正曲線(xiàn)的線(xiàn)性范圍有所區別外,數據處理同上類(lèi)似。盡管存在一些不足之處,但是ELSD作為一種新型的通用型質(zhì)量檢測器,具有許多獨特的優(yōu)勢,例如它的通用性,響應因子的一致性以及與梯度洗脫相容等,將在無(wú)特征紫外吸收物質(zhì)的分析方面發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。
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