液相色譜柱，是一種用于液體色譜分析儀器的，液相色譜柱和液質(zhì)色譜柱可以混用。
1.色譜柱它包括空柱和填料?？罩莾?nèi)壁拋光的不銹鋼管，內(nèi)徑為4～5mm，長100～250mm。按氣相色譜法中洗滌空柱的方法洗凈，用勻漿法填充固定相。將此柱裝入儀器的管路中，用柱式機(jī)械往復(fù)泵輸入新鮮脫氣的流動相。等基線平直后可用苯、萘、菲的混合試液，用正己烷(含 0.05%甲醇)或甲醇：水(83：17)為流動相測定柱效及分離度塔板數(shù)在2～3萬/ml以上及分離度在1.5以上者，柱效好。為防止柱污染，常用1個 50mm長，4~5mm內(nèi)徑，裝有硅膠(40-50mm)或立柱相同填料的保護(hù)柱(預(yù)柱)接在主柱之前，以延長色譜柱的壽命。反相鍵合相柱用畢。必須用水充分流經(jīng)，以洗去鹽類、酸堿等雜質(zhì)防止柱生銹及填料中雜質(zhì)的積聚，再用甲醇流經(jīng)洗滌使色譜柱獲得再生。
2.流動相的洗脫方式配好經(jīng)脫氣的流動相放于貯液瓶中，經(jīng)過有濾過頭、內(nèi)徑2mm的聚四氟乙烯管流入高壓泵進(jìn)入色譜柱，最后自檢測器流出或收集或作廢液回收。用流動相洗脫的方式有恒溶劑脫洗法(isocratic dlution)，即自洗脫開始到結(jié)束，溶劑的配比恒定。另一類為梯度洗脫法(gradicnt clution),即使溶劑的極性強(qiáng)度在色譜過程中逐漸增加。須按一定程序不斷改變流動相的濃度配比，從而使同一個試樣中組分性質(zhì)相差較小的及較大的都能在一次色譜過程中很好分離，而整個色譜過程縮短。必須注意，梯度洗脫法不能用于分子排阻色譜及用電化學(xué)檢測的反相高效液相色譜法中。
3.檢測器適用于血藥濃度的檢測器有紫外線吸收，熒光發(fā)射和電化學(xué)三種。紫外檢測器應(yīng)用于對紫外光有吸收的藥物，大多數(shù)藥物分子對紫外光有吸收，故能較普遍采用，檢測限有0.1μg左右。紫外檢測器有固定波長型、可變波長型及掃描器，既能使流動相停流作組分的定性定量檢測，又能提高測定靈敏度，重現(xiàn)性較好。熒光發(fā)射檢測器對能產(chǎn)生熒光的藥物才能使用。80年代應(yīng)用激光替代氙燈光源，光強(qiáng)度增加了3~4倍，對某些藥物的檢測限可達(dá)pg級。電化學(xué)檢測器是由一個碳糊或破碳做成的蒲層電解池。常用于檢測兒茶酚胺類及有酚類基團(tuán)的各種藥物和代謝物。流出組分進(jìn)入2μl的薄層電解池，在一暄電壓下電解產(chǎn)生電流，放大后檢測，檢測限pg級。
4.數(shù)據(jù)處理現(xiàn)代高效液相色譜儀帶有數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，除記錄譜外，還能自動記錄峰的保留時間，能自動積分求算峰面積，并能按照預(yù)定的程序作有關(guān)計算，報告分析結(jié)果。
高效液相色譜儀使用過程中常見問題及其解決方法
1 液相色譜儀系統(tǒng)
液相色譜儀主要由貯液瓶、泵、進(jìn)樣器、柱、柱溫箱、檢測器、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成(如圖1所示)。對于整個系統(tǒng)而言，柱子、泵和檢測器是核心部件，同時也是容易出事故的主要場所。
2 常見問題及解決方法
2.1 針對柱壓問題(表1)
柱壓問題是使用高效液相色譜過程中需要密切注意的地方，柱壓的穩(wěn)定與色譜圖峰形的好壞、柱效、分離效果及保留時間等密切相關(guān)。所謂柱壓穩(wěn)定并不是指壓力值穩(wěn)定于一個恒定值，而是指壓力波動范圍在50PSI之間。壓力過高、過低及波動較大都屬于柱壓問題，但柱壓的高低與色譜柱的種類、品牌、液相系統(tǒng)本身及使用的流動相種類相聯(lián)系。值得注意的是在使用梯度洗脫時，進(jìn)柱壓的平穩(wěn)緩慢的變化是允許的。
在實際應(yīng)用中柱壓過高可從以下幾個方面來考慮。首先考慮柱子是否被堵，此時可更換一根新柱子進(jìn)行檢測。
2.2 針對保留時間漂移的問題
保留時間的改變是很多液相色譜使用者常碰到的問題，其包括了保留時間增大和減小。它的產(chǎn)生與很多原因有關(guān)。
2.3 針對異常色譜峰問題
異常的色譜峰指的是色譜圖中無峰或出現(xiàn)負(fù)峰、寬峰、雙峰、肩峰、峰形不對稱等情況。具體情況與原因分析如表3。
3 高效液相色譜儀的保養(yǎng)
3.1 HPLC的日常操作條件
工作溫度10～30℃; 相對濕度<80%; 最好是恒溫、恒濕，遠(yuǎn)離高電干擾、高振動設(shè)備。
3.2 泵的保養(yǎng)
使用流動相盡量要清潔;進(jìn)液處的沙芯過濾頭要經(jīng)常清洗;流動相交換時要防止沉淀;避免泵內(nèi)堵塞或有氣泡。
3.3 進(jìn)樣器的保養(yǎng)
每次分析結(jié)束后，要反復(fù)沖洗進(jìn)樣口，防止樣品的交叉污染。
3.4 柱的保養(yǎng)
柱子在任何情況下不能碰撞、彎曲或強(qiáng)烈震動;當(dāng)柱子和色譜儀連接時，閥件或管路一定要清洗干凈;要注意流動相的脫氣; 避免使用高粘度的溶劑作為流動相;進(jìn)樣樣品要提純;嚴(yán)格控制進(jìn)樣量;每天分析工作結(jié)束后，要清洗進(jìn)樣閥中殘留的樣品;每天分析測定結(jié)束后，都要用適當(dāng)?shù)娜軇﹣砬逑粗?若分析柱長期不使用，應(yīng)用適當(dāng)有機(jī)溶劑保存并封閉。
3.5 檢測器(UV)的保養(yǎng)
紫外燈的保養(yǎng)要在分析前、柱平衡得差不多時，打開檢測器;在分析完成后，馬上關(guān)閉檢測器。同時樣品池要保養(yǎng)。
4 結(jié)語
在高效液相色譜使用過程中故障排出時要遵守以下原則：一次只改變一個因素，從而確定假定因素與問題之間的聯(lián)系;如果通過更換組件來排查故障時要注意將拆下的完好組件裝回原位，從而避免浪費;養(yǎng)成良好的記錄習(xí)慣，一個良好的記錄是成功地進(jìn)行故障排除的關(guān)鍵。
總之，在使用高效液相色譜時一定要注意樣品的前處理與儀器的正確操作和保養(yǎng)，儀器系統(tǒng)的干凈是用好儀器和維護(hù)維修儀器的關(guān)鍵。
