【液相色譜儀系統】液相色譜儀主要由貯液瓶、泵、進(jìn)樣器、柱子、柱溫箱、檢測器、數據處理系統組成。對于整個(gè)系統而言，柱子、泵和檢測器是核心部件同時(shí)也是易出問(wèn)題的主要部位。
液相色譜儀常見(jiàn)問(wèn)題及解決方法
一、柱壓?jiǎn)?wèn)題
柱壓?jiǎn)?wèn)題是使用液相色譜過(guò)程中需要密切注意的地方，柱壓的穩定與色譜圖峰形的好壞、柱效、分離效果及保留時(shí)間等密切相關(guān)。所謂柱壓穩定并不是指壓力值穩定于一個(gè)恒定值而是指壓力波動(dòng)范圍在345kPa 以?xún)然蛟?0PSI之間(在使用梯度洗脫時(shí)，柱壓平穩緩慢的變化是允許的)。壓力過(guò)高、過(guò)低都屬于柱壓?jiǎn)?wèn)題。
1、壓力過(guò)高這是液相在使用中常見(jiàn)的問(wèn)題，指的是壓力突然升高，
一般都是由于流路中有堵塞的原因。此時(shí)，我們應該分段進(jìn)行檢查。
(1).首先斷開(kāi)真空泵的入口處，此時(shí)PEEK管里充滿(mǎn)液體，使PEEK管低于溶劑瓶，看液體是否自由滴下，如果液體不滴或緩慢滴下，則是溶劑過(guò)濾頭堵塞。處理方法：用30%的硝酸浸泡半個(gè)小時(shí)，在用超純水沖洗干凈。如果液體自由滴下，溶劑過(guò)濾頭正常，在檢查；
(2).打開(kāi)Purge閥，使流動(dòng)相不經(jīng)過(guò)柱子，如果壓力沒(méi)有明顯下降，則是過(guò)濾白頭堵塞。處理方法：將過(guò)濾白頭取出，用10%的異丙醇超聲半個(gè)小時(shí)。如果壓力降至100PSI以下，過(guò)濾白頭正常，在檢查；
(3).把色譜柱出口端取下，如果壓力不下降，則是柱子堵塞。處理方法：如果是緩沖鹽堵塞，則用95%的水沖至壓力正常。如果是一些強保留的物質(zhì)導致堵塞，則要用比現在流動(dòng)相更強的流動(dòng)相沖至壓力正常。假如按上面的方法長(cháng)時(shí)間沖洗壓力都不下降，則可考慮將柱子的進(jìn)出口反過(guò)來(lái)接在儀器上，用流動(dòng)相沖洗柱子。這時(shí)，如果柱壓仍不下降，只有換柱子入口篩板，但一旦操作不甚，很容易造成柱效下降，所以盡量少用。問(wèn)題無(wú)法解決可考慮更換色譜柱。
2、流速設定不正確：可重新設定正確流量。
3、流動(dòng)相配比不正確：不同配比的流動(dòng)相其黏度系數不相同，較高黏度的流動(dòng)相相應的系統壓力也大，如果可能可更換黏度較小的溶劑或重新設定配比。4、系統壓力零點(diǎn)漂移：調節壓力傳感器的零點(diǎn)。
2壓力過(guò)低
1、一般是由于系統泄漏，處理方法：尋找各個(gè)接口處，特別是色譜柱兩端的接口，把泄漏的地方旋緊即可。拆下柱子加適當力擰緊或襯四氟薄膜。
2、泵里進(jìn)了空氣，但此時(shí)表現的往往是壓力不穩，忽高忽低，更嚴重一點(diǎn)會(huì )導致泵無(wú)法吸上液體。處理方法：打開(kāi)Purge閥，用3~5ml/min的流速沖洗，如果不行，則要用專(zhuān)用針筒在排空閥處借住外力將氣泡吸出。
3、無(wú)流動(dòng)相流出：檢查儲液瓶中有無(wú)流動(dòng)相，沉子是否浸在流動(dòng)相中，泵是否運行。
4、參比閥未關(guān)閉：將流速降低后關(guān)閉參比閥。一般降至0.1～0.2mL/min后關(guān)閉參比閥。
基線(xiàn)問(wèn)題
1基線(xiàn)漂移基線(xiàn)漂移是色譜工作者普遍遇到的問(wèn)題,在實(shí)際工作中,我們經(jīng)常能遇到基線(xiàn)漂移的情況,特別是在梯度洗脫的時(shí)候,基線(xiàn)漂移是常有的事。一般說(shuō)來(lái)，機器剛起動(dòng)時(shí)，基線(xiàn)容易漂移，大概要30min的平衡時(shí)間，如果你用了緩沖溶液或緩沖鹽，還有就是在低波長(cháng)下(220nm)平衡時(shí)間相對會(huì )比較長(cháng)，但如果你在實(shí)驗過(guò)程中發(fā)現基線(xiàn)漂移，則你要考慮下面的原因：
1、柱溫波動(dòng) 控制好柱子和流動(dòng)相的溫度，檢查是否有打開(kāi)的窗戶(hù)或空調對著(zhù)柱溫箱。
2、(即使是很小的溫度變化都會(huì )引起基線(xiàn)的波動(dòng)。通常影響示差檢測器、電導檢測器、較低靈敏度的紫外檢測器或其它光電類(lèi)檢測器。)控制好柱子和流動(dòng)相的溫度,在檢測器之前使用熱交換器。
3、流通池被污染或有氣體 用甲醇或其他強極性溶劑沖洗流通池(應斷開(kāi)柱子)。如有需要，可以用1N的硝酸(不要用鹽酸)。
4、紫外燈能量不足 更換新的紫外燈
5、流動(dòng)相污染、變質(zhì)或由低品質(zhì)溶劑配成。 檢查流動(dòng)相的組成，使用高品質(zhì)的化學(xué)試劑及HPLC級的溶劑。
2基線(xiàn)噪音
對于紫外檢測器, 氘燈光源打開(kāi)后要預熱30 min以上, 基線(xiàn)才能穩定。噪聲是指與被測物無(wú)關(guān)的檢測器輸出信號的隨機擾動(dòng)變化, 分短期噪聲和長(cháng)期噪聲兩種。
氘燈用的過(guò)久, 接近壽命期時(shí)( 氘燈的壽命約1 000 h) , 會(huì )使基線(xiàn)噪音明顯增加, 應及時(shí)更換氘燈。除光源外, 流路中的氣泡也會(huì )產(chǎn)生噪音。對于判斷基線(xiàn)噪聲增大是由于光源燈的老化還是來(lái)自流路中的氣泡的問(wèn)題, 可將泵關(guān)上, 繼續走基線(xiàn), 如果噪聲立即停止, 基線(xiàn)呈一條直線(xiàn), 說(shuō)明基線(xiàn)噪聲來(lái)自流動(dòng)相中的氣泡, 應設法排氣； 若停泵后仍有噪音出現, 應考慮是燈的問(wèn)題。
基線(xiàn)噪音(規則的)
產(chǎn)生基線(xiàn)噪音的原因有：在流動(dòng)相、檢測器或泵中有空氣；漏液；流動(dòng)相混合不完全；溫度影響(柱溫過(guò)高,檢測器未加熱)；在同一條線(xiàn)上有其他電子設備；泵振動(dòng)。
了避免基線(xiàn)噪音,在正式進(jìn)樣之前,需要對流動(dòng)相脫氣；沖洗系統以除去檢測器或泵中的空氣；檢查管路接頭是否松動(dòng)；泵是否漏液；是否有鹽析出和不正常的噪音,如有必要,更換泵密封；用手搖動(dòng)使溶劑混合均勻或使用低粘度的溶劑減少差異或加上熱交換器；有其他電子設備時(shí)斷開(kāi)LC、檢測器和記錄儀,檢查干擾是否來(lái)自于外部,加以更正；泵振動(dòng)時(shí)在系統中加入脈沖阻尼器。
基線(xiàn)噪音(不規則的)
(1) 漏液：檢查接頭是否松動(dòng),泵是否漏液,是否有鹽析出和不正常的噪音。如有必要,更換密封,檢查流通池是否漏液。
(2) 流動(dòng)相污染、變質(zhì)或由低質(zhì)溶劑配成：檢查流動(dòng)相的組成。
(3) 流動(dòng)相各溶劑不相溶：選擇互溶的流動(dòng)相。
(4) 檢測器/記錄儀電子元件的問(wèn)題：斷開(kāi)檢測器和記錄儀的電源,檢查并更正。
(5) 系統內有氣泡：用強極性溶液清洗系統；檢測器內有氣泡,清洗檢測器,在檢測器后面安裝背景壓力調節器。
(6) 流通池污染(即使是極少的污染物也會(huì )產(chǎn)生噪音) :用硝酸清洗流通池；
(7) 檢測器燈能量時(shí)不足更換燈；
(8) 色譜柱填料流失或阻塞:更換色譜柱。
(9) 流動(dòng)相混合不均勻或混合器工作不正常:維修或更換混合器,在流動(dòng)相不走梯度時(shí),不建議使用泵的混合裝置。
保留時(shí)間
保留時(shí)間的漂移往往由柱老化引起,而柱老化不可能引起保留時(shí)間的無(wú)規律波動(dòng)。事實(shí)上,保留時(shí)間漂移的多半原因是由于不同機理的色譜柱老化,如固定相流失(例如通過(guò)水解) ,色譜柱污染(由樣品或流動(dòng)相所致)等。保留時(shí)間漂移的幾種常見(jiàn)的原因和解決方法如下：
1色譜柱平衡
如果觀(guān)察到保留時(shí)間漂移,首先應考慮色譜柱是否已經(jīng)平衡。在每一次運行之前給予足夠的時(shí)間平衡色譜柱。通常平衡需要10～20個(gè)柱體積的流動(dòng)相,但如果在流動(dòng)相中加入少量添加劑(如離子對試劑)則需要相當長(cháng)的時(shí)間來(lái)平衡色譜柱。流動(dòng)相污染也可能是原因之一。溶于流動(dòng)相中的少量污染物可能慢慢富集到色譜柱上,從而造成保留時(shí)間的漂移。應注意:水是很容易污染的流動(dòng)相成分。
2固定相穩定性
固定相的穩定性都是有限的,即使在推薦的pH范圍內使用,固定相也會(huì )慢慢水解。例如,硅膠基質(zhì)在pH4時(shí)水解穩定性較好,水解速度與流動(dòng)相類(lèi)型和配體有關(guān)。雙官能團配體和三官能團配體比單官能團配體的鍵合相要穩定；長(cháng)鏈鍵合相比短鏈鍵合相穩定；烷基鍵合相比氰基鍵合相穩定的多。經(jīng)常清洗色譜柱亦會(huì )加速色譜柱固定相的水解。其他硅膠基質(zhì)鍵合相在水溶液環(huán)境中也可以發(fā)生水解,如氨基鍵合相等。
3色譜柱污染
保留時(shí)間漂移的另一個(gè)常見(jiàn)原因是色譜柱污染。HPLC色譜柱是非常有效的吸附性過(guò)濾器,它可以過(guò)濾并吸附流動(dòng)相攜帶的任何物質(zhì)。污染源可以是:流動(dòng)相本身,流動(dòng)相容器,連接管、泵、進(jìn)樣器和儀器密封墊,以及樣品等。通常通過(guò)實(shí)驗可判斷污染的來(lái)源。樣品中如果存在色譜柱上保留很強的組分,就可能是使保留時(shí)間漂移的潛在根源。這些根源通常是樣品基質(zhì),如:配藥中的賦形劑,生化樣品(如血清)中的蛋白及類(lèi)脂類(lèi)化合物,食品樣品中的淀粉,環(huán)境水樣中的腐殖酸等。通常樣品中的強保留組分具有較高的分子量,在此情況下,保留時(shí)間漂移的同時(shí)或其后會(huì )有反壓的增加,可以通過(guò)使用固相提取( SPE)等樣品前處理方法來(lái)去除樣品基質(zhì)的影響,避免色譜柱污染簡(jiǎn)單的方法是防患于未然。相比之下,找到問(wèn)題的所在并設計有效的清洗步驟以去除污染物要困難的多。通常使用在給定色譜條件下的強溶劑,但并非所有污染物都可以在流動(dòng)相中溶解。如THF可去除反相色譜柱中的許多污染物,但蛋白在THF中就不能溶解, DMSO常常用于去除反相色譜柱中的蛋白。使用保護柱是個(gè)非常有效的方法。反沖色譜柱僅是不得已時(shí)采用的辦法。
4流動(dòng)相組成
流動(dòng)相組成的緩慢變化也是保留時(shí)間漂移的常見(jiàn)原因。如流動(dòng)相中易揮發(fā)組分的揮發(fā)及循環(huán)使用流動(dòng)相等,應防止流動(dòng)相由于蒸發(fā)、反應等等原因造成的變化。
保留時(shí)間重現是液相性能好壞的一個(gè)重要標志，同一種東西，兩次的保留時(shí)間相差不要超過(guò)15s，超過(guò)了半分鐘可看做保留時(shí)間漂移，就無(wú)法進(jìn)行定性。
峰型異常問(wèn)題
峰型問(wèn)題是液相的主要問(wèn)題，在做液相過(guò)程中，我們就是要變換不同的條件來(lái)改善不好的峰型，對于各種各樣的異常峰，要區別對待，從主要問(wèn)題出發(fā)，一個(gè)一個(gè)加以解決。
1.色譜圖中未出峰
系統未進(jìn)樣或樣品分解；泵未輸液或流動(dòng)相使用不正確；檢測器設置不正確；針對以上情況成因作相應調整即可。
2.一個(gè)峰或幾個(gè)峰是負峰
流動(dòng)相吸收本底高；進(jìn)樣過(guò)程中進(jìn)入空氣；樣品組分的吸收低于流動(dòng)相。
3.所有峰均為負峰
信號電纜接反或檢測器輸出極性設置顛倒；光學(xué)裝置尚未達到平衡。
4.所有峰均為寬峰
系統未達到平衡；溶解樣品的溶劑極性比流動(dòng)相差很多；色譜柱尺寸及類(lèi)型選擇不正確；色譜柱或保護柱被污染或柱效降低；溫度變化造成的影響。
5.所出峰比預想的小
樣品黏度過(guò)大；進(jìn)樣品故障或進(jìn)樣體積誤差；檢測器設置不正確.定量環(huán)體積不正確；檢測池污染；檢測器燈出現問(wèn)題。
6.出現雙峰或肩峰
進(jìn)樣量過(guò)大；樣品濃度過(guò)高；保護柱或色譜柱柱頭堵塞；保護拄或色譜柱污染或失效；柱塌陷或形成短通道。
7.前伸峰
進(jìn)樣量或樣品濃度高，溶解樣品的溶劑較流動(dòng)相極性強；保護柱或色譜柱污染或失效。
①柱溫低：升高柱溫；②樣品溶劑選擇不恰當：使用流動(dòng)相作為樣品溶劑；③樣品過(guò)載：降低樣品含量；④色譜柱損壞：更換柱子。
8.拖尾峰
柱超載，降低樣品量；增加柱直徑采用較高容量的固定相；峰干擾，對樣品進(jìn)行清潔過(guò)濾；調整流動(dòng)相；硅羥基作用，加入三乙胺，用堿致鈍化柱增加緩沖液或鹽的濃度降低流動(dòng)相pH值；柱內燒結不銹鋼失效，更換燒結不銹鋼；加在線(xiàn)過(guò)濾器，對樣品進(jìn)行過(guò)濾；死體積或柱外體積過(guò)大，將連接點(diǎn)降至低；盡可能使用內徑較細的連接管；柱效下降，更換柱子；采用保護柱，對柱子進(jìn)行再生。
9.出現平頭峰
檢測器設置不正確；進(jìn)樣體積太大或樣品濃度太高。
10.出現鬼峰
進(jìn)樣閥殘余峰，可能為上次樣品的殘余。在每次進(jìn)完樣后用充足的時(shí)間來(lái)平衡和清洗系統；樣品中存在未知物，改進(jìn)樣品的預處理；流動(dòng)相污染，更換新流動(dòng)相，盡可能現配現用，隔夜的流動(dòng)相再次使用時(shí)要過(guò)濾；盡可能使用HPLC級試劑；流路中有小的氣泡，打開(kāi)Purge閥，加大流速排除。
11.峰分叉
①保護柱或分析柱污染：取下保護柱再進(jìn)行分析,如果必要更換保護柱。如果分析柱阻塞,拆下來(lái)清洗。如果問(wèn)題仍然存在,可能是柱子被強保留物質(zhì)污染,運用適當的再生措施。如果問(wèn)題仍然存在,入口可能被阻塞,更換篩板或更換色譜柱。②樣品溶劑不溶于流動(dòng)相改變樣品溶劑,如果可能采取流動(dòng)相作為樣品溶劑。
12.峰變形
樣品過(guò)載，減少樣品載量。
13.早出的峰變形
樣品溶劑選擇不恰當 ①減少進(jìn)樣體積 ②運用低極性樣品溶劑
14.早出的峰拖尾程度大于晚出的峰
柱外效應 ①調整系統連接(使用更短、內徑更小的管路) ②使用小體積的流通池
15.酸性或堿性化合物的峰拖尾
緩沖不合適①使用濃度50～100 mM的緩沖液②使用Pka等于流動(dòng)相pH值的緩沖液
16.額外的峰
(1)樣品中有其他組分：正?，F象；
(2)前一次進(jìn)樣的洗脫峰：①增加運行時(shí)間或梯度斜率②提高流速；
(3)空位或鬼峰：①檢查流動(dòng)相是否純凈 ②使用流動(dòng)相作為樣品溶劑 ③減少進(jìn)樣體積。
小結
以上內容只是譜析儀器工程師對液相色譜中出現的常見(jiàn)的問(wèn)題進(jìn)行了分析，當然在我們實(shí)際應用當中還會(huì )遇到更多的其它問(wèn)題，在故障排除時(shí)要遵守以下原則：一次只改變一個(gè)因素，確定假定因素與問(wèn)題之間的聯(lián)系；如果通過(guò)更換組件來(lái)排查故障時(shí)要注意將拆下的完好組件裝回原位，避免浪費；養成良好的記錄習慣，這是成功進(jìn)行故障排除的關(guān)鍵?？傊?，在使用液相色譜時(shí)一定要注意樣品的前處理與儀器的正確操作和保養。